Descripción

Flipper-TR es una sonda fluorescente para membranas de células vivas de la marca SpiroChrome, se dirige específicamente a la membrana plasmática de las células e informa los cambios de tensión de la membrana, a través de su cambio en la fluorescencia. Esto es lo más avanzado en sondas de la familia Flipper, en el que detecta los cambios en la organización de la bicapa lipídica mediante cambios en el ángulo de giro y la polarización entre los dos giros de ditiotreitol del mecanóforo.

Flipper-TR se inserta espontáneamente en la membrana plasmática de las células, y solo es fluorescente cuando se inserta en una membrana lipídica. Tiene un amplio espectro de absorción y emisión. La excitación solo es con un láser de 488nm, mientras que la emisión es colectada entre 575 y 625nm. Flipper-TR funciona en una gran gamma de organismos incluidos bacterias, levaduras, mamíferos y plantas.

Propiedades

Protocolo de marcaje
Nota: Este protocolo fue optimizado usando células HeLa adheridas a un portaobjeto, y ha sido confirmado en otras líneas celulares comunes. Las recomendaciones para protocolos experimentales se deben utilizar como punto de partida y las condiciones de etiquetado óptimas para cada tipo de célula se deben determinar empíricamente.

Preparar la solución de stock a 1mM:
Disolver el contenido del vial Flipper-TR en 50ul de DMSO anhídrido para hacer una solución de stock a 1mM. Esta solución deberá estar almacenada a -20°C o por debajo. No dividir la solución en pequeñas alícuotas, ya que pueden descomponerse rápidamente. Los componentes no se alteran por la congelación y la descongelación múltiple. Cuando se almacena correctamente, esta solución de stock debe ser estable durante 3 meses o más. Opcionalmente si la concentración de la solución de stock necesita ser determinada con precisión, diluir 1ul de la solución de stock 1mM en 99ul de DMSO. Medir la absorbancia a 425nm. Calcular la concentración usando el coeficiente de extinción dado en la parte de arriba.

Preparar la solución de tinción: Diluir Flipper-TR a la concentración deseada (empiece por 1uM) en el medio de cultivo celular poco antes de aplicar las células (no mantenga por muchas horas la solución de tinción antes de usarla). Nota: cuando se use un medio de cultivo con suero de ternero fetal u otro suero, la eficiencia de etiquetado puede ser reducida comparado con medios carentes de suero. Si una señal baja es observada, la concentración de la sonda puede incrementarse a 2uM.

Preparación celular y tinción: El crecimiento de las células sobre los portaobjetos, placa de fondo de vidrio o placas fondo de vidrio multi-pozos se realizará como de costumbre. Cuando las células han alcanzado la densidad deseada, remplace el medio de cultivo por la solución de tinción asegurándose que todas las células están cubiertas con la solución. Coloque las células en la incubadora a 37°C en un ambiente de humedad conteniendo 5% de CO2 por 15 minutos antes de tomar imágenes. Después de 30 minutos o más, la tinción de las estructuras endosomicas pueden ser visibles debido a la rotación de la membrana.

Sin embargo, la tinción en organelos que contengan membranas será limitada (ER, golgi). Las estructuras del endosoma suelen tener una vida útil más baja. Opcionalmente, el medio que contiene la sonda se puede eliminar y las células se pueden lavar una vez en medio fresco. Como la sonda es fluorescente solo en las membranas, la sonda no necesita ser eliminada, especialmente en casos donde el medio contiene suero, cuando se planea obtener imágenes a largo plazo (>/-24h). No se ha observado ningún impacto en la viabilidad celular después de 2-3 días de incubación con la sonda en concentraciones inferiores a 1uM.

Imágenes FLIM: Las imágenes de las células se realizan con microscopios film estándar utilizando un láser de 485 o 488nm para la excitación y la recolección de fotones a través de un filtro bandpass de 600/50nm. Recomendamos optimizar el procedimiento de marcaje, así como, la configuración de adquisición de imágenes para minimizar el fotodaño inducido por la excitación de luz a 488nm en muestras en vivo. Para extraer información sobre el tiempo de vida, los histogramas de fotones de ROI o pixeles individuales (acumular suficientes conteos para garantizar buenas estadísticas) están ajustados con una doble exponencial y se extraen dos tiempos de caída, t1 y t2. El tiempo más largo con la amplitud de ajuste más alta t1 se usa para reportar la tensión de la membrana y varía entre 2.8 y 7.0 ns. El tiempo de vida más largo significa más tensión en la membrana. t2 con un valor más pequeño (entre 0.5 y 2ns) y una pequeña amplitud de ajuste es menos adecuada para estudiar la tensión de la membrana.

Notas importantes:

• Las mediciones de la tensión de membrana solo se pueden realizar mediante microscopía FILM, la intensidad de fluorescencia o la longitud de onda no informa de manera confiable sobre la tensión de la membrana.
• Los sistemas en los que la composición lipídica cambia con el tiempo también inducen un cambio en el tiempo de vida de Flipper-TR.
•  Las imágenes FLIM son una técnica de microscopia avanzada que requiere de un sistema de microscopia FLIM comercial o hecho a la medida con los láseres de excitación adecuados, los sistemas de conteo de fotones y los filtros de emisión. Se recomienda a los clientes que consulten a una persona responsable de su instrumento o se ponga en contacto con el fabricante del microscopio para asegurarse de que su sistema pueda captar la vida útil de la fluorescencia de Flipper-TR.

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