Después de ejecutar el ensayo de ELISA, usted puede separar los datos en bruto en tres partes. Se recomienda ejecutar los estándares y las muestras por duplicado o triplicado. Como mejor práctica, es mejor controlar el CV de las réplicas menos del 8%.

• Parte 1: Absorbancia de estándares con concentración conocida.
• Parte 2: Absorbancia de pozo en blanco / fondo
• Parte 3: Absorbancia de muestras con concentración desconocida.

Los estándares se diluyen en serie con diluyente de muestra. Las muestras también pueden necesitar ser diluidas. Dado que el diluyente de la muestra tiene absorbancia incluso cuando no hay una proteína presente en la longitud de onda de detección, se ejecuta EL POZO blanco con el diluyente de la muestra en el ensayo para obtener la OD de fondo. Es una práctica común restar la absorbancia del pozo blanco de los estándares y toda la absorbancia de la muestra.

Tomamos Human TNF-∝ ELISA kit (CSB-E04740h) como un ejemplo.  La absorbancia tanto de los estándares como de las muestras se corrige al restar el OD del pozo blanco. 

Aquí utilizamos “Curve Expert 1.4”, como ejemplo para mostrarle como operar el software y procesar el análisis de datos. 

1.1 Inicie “Curve Expert 1.4”. Puedes ver una interfaz abajo. 

1.2 Valores de entrada OD (eje X) y concentración correspondiente (eje Y) de los estándares. Puede copiar los datos de la hoja de Excel directamente a la hoja de cálculo del software. El gráfico de datos aparece en la esquina inferior derecha. 

2.1 Haga clic en el botón [Run] y deje que el software examine sus datos para elegir el mejor ajuste posible de la curva. Seleccione las familias modelo que se incluirán en el cálculo. Por lo general, hacemos clic en [All On] para incluir todas las familias modelo. Si la familia polinómica se incluye para su consideración, debe especificar el grado máximo del polinomio que el software considerará en el área de “restricción de polinómios”. Se recomienda establecer el grado máximo de polinomio como “4”. Por supuesto, si la familia polinomial no está incluida, la restricción polinomial simplemente será ignorada. Luego presione [ OK ].

2.2 El cálculo continuará, y cada ajuste de curva se clasificará de acuerdo con su error estándar y coeficiente de correlación, y el mejor ajuste se muestra en la ventana gráfica.

Aunque el software recomendará la mejor curva de ajuste, aún puede seleccionar la curva manualmente haciendo doble clic en una regresión diferente. Seleccione la curva con el valor “r” más cercano a “1”.

La selección de una regresión de ajuste de curva adecuada es importante ya que la concentración de las muestras se calculará de acuerdo con la curva estándar. Las siguientes figuras ilustran, como diferentes curvas estándar de ELISA afectan la precisión de los cálculos  de concentración. Cuanto más cercano sea el valor de “r” a “1”, mayor será la correlación entre OD y la concentración. 

Este es un ejemplo para mostrar como diferentes curvas estándar afectan el resultado. Si una muestra de prueba produce una absorbancia de 1.4, las dos concentraciones correspondientes calculadas por la curva lineal (r=0.92255796) y la curva no lineal (r=0.99993479) tiene una gran diferencia (199.955 VS 114.898). 

En este ejemplo, finalmente seleccionamos “Función Racial” ya qye su valor “r” es el más cercano a “1” en comparación con otras curvas estándar. Al presionar el botón derecho del mause o al presionar Ctrl-M en cualquier ventana de gráficos, se puede seleccionar desde el menú de gráficos. Al hacer clic en el botón [Copiar] puede pegar un gráfico estándar para sobresalir en una hoja o documento de Word. 

¿Cómo calcular la concentración? Tienes dos formas de calcular la concentración de proteína blanco. 

• Analizar los datos de ELISA en el software 

El software permite la ubicación fácil de los puntos x/y, diferenciación e integración de un ajuste de curva que se ha realizado seleccionando (Analizar) en el menú de gráficos o presionando Ctrl-L. En este ejemplo, nos gustaría encontrar la concentración de la proteína blanco (valor Y), mediante la evaluación de la curva de ajuste en un OD dado (valor X). Simplemente escriba el punto en el que desea evaluar el ajuste de la curva (el valor x) en el campo “at X=” y pulse [ calcular] o [ Enter] en el teclado. A continuación, la calculadora mostrará el valor y correspondiente. 

• Analizar los datos de ELISA en la hoja de MS Excel. 

Presione el botón [info] para abrir el cuadro de diálogo de información del modelo que proporciona toda la información  necesaria para aplicar un ajuste de curva y cierta información complementaria  sobre el rendimiento del modelo dado. La información más importante contenida en este panel son los valores de los parámetros del modelo. 

Modelo 

La sección modelo da la ecuación de modelado de datos para que la interpretación de los coeficientes sea clara. Los coeficientes a,b,c, etc. en la sección Coeficientes coinciden con los parámetros correspondientes indicados en el modelo. 

Coeficientes 

La sección Coeficientes proporciona los valores de los parámetros relevantes para el modelo actual; estos coeficientes siempre se expresan como a,b,c,d, etc. Estos coeficientes coinciden con el modelo que se muestra en la sección Modelo. Si la lista de coeficientes supera la extensión de la ventana en la que se muestran, aparecerá una barra de desplazamiento que le permitirá desplazarse por los parámetros. 

Si hacemos clic en [Copiar], la lista de coeficientes se copia en el portapapeles. Luego pégalos en cualquier hoja de Excel. 

Introduzca el valor de X (OD), a, b, c, d en la fórmula respectivamente y, a continuación, pulse [Enter] en el teclado para calcular la concentración. Para obtener los resultados más precisos, se recomienda hacer un pre-texto para determinar el factor de dilución apropiado para asegurarse de que la concentración de proteína blanco en las muestras después de que la  dilución caiga en el rango de la curva estándar. Si lo muestra se ha diluido, el factor de dilución debe tenerse en cuenta durante el cálculo. 

La curva estándar es tan importante para obtener el análisis de los resultados de ELISA con precisión. Por lo tanto, se debe ejecutar estándares en cada ensayo para evitar la desviación sistemática causada por la diferencia en el operador, el pipeteo, las incubaciones y la temperatura de cada ensayo.